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Thiopurine Méthyl Transférase, TPMT

Rationnel :  la TPMT est une enzyme de phase II qui ajoute un radical méthyl à ses substrats (enzyme de conjugaison). On ne connait pas de substrat endogène et les 3 médicaments connus pour être méthylés par cette enzymes sont l’azathioprine, la 6-mercaptopurine et la thioguanine. La S-méthylation de ces 3 médicaments cytotoxiques conduit à leur inactivation. Ces médicaments sont utilisés comme anticancéreux dans le traitement de consolidation des leucémies aigues lymphocytaires de l’enfant et comme immunosuppresseurs en greffe rénale (rarement de nos jours) et plus fréquemment dans la maladie de Crohn. L’activité de la TPMT est facilement mesurable dans les globules rouges (phénotypage). L’activité TPMT est génétiquement déterminée. Chez les sujets déficients le risque est l’hématotoxicité (surtout les neutropénies).
Identification des SNPs : Trois SNPs (rs1800462, rs1142345, rs1800460) permettent de détecter plus de 95% des sujets génétiquement déficients bien qu’on connaisse environ 23 variants délétères au total mais dont la fréquence allélique est très faible.
Allèle TPMT*2 (rs1800462, c.238G>C, Pro80Ala)
Allèle TPMT*3C (rs1142345, c.719A>G, Tyr240Cys)
Allèle TPMT*3A associe 2 SNP (rs1800460, c.460G>A, Ala154Thr) et (rs1142345 c.719A>G, Tyr240Cys)
Allèle TPMT*3B (rs1800460, c.460G>A, Ala154Thr)
Fréquence du polymorphisme :
Allèle TPMT*2 : :freq allélique inférieure à 1%
Allèle TPMT*3C : freq allélique = 0,01 à 0,02 chez les Occidentaux et les Asiatiques et 0,06 chez les sujets d’origine Africaine
Allèle TPMT*3A : freq allélique environ 0,1 chez les Occidentaux
TPMT*3B : freq allélique (rs1800460, c.460G>A, Ala154Thr) sans être associée à l’allèle rs1142345 de l’ordre de 1/120 000.
Fonctionalité du polymorphisme chez l’homme: On distingue au plan phénotypique des métabolseurs lents (homozygotes mutés ou doubles hétérozygotes soit 0,3% de la population), des métaboliseurs intermédiaires (hétérozygotes pour un variant allélique, soit 10% de la population) et des métaboliseurs rapides (homozygotes sauvages, 90% de la population). Il existe une excellente corrélation entre phénotype et génotype. On peut donc soit génotyper (3 principaux variants) soit phénotyper (activité de la TPMT érythrocytaire) soit les 2. L’interprétation peut être parfois délicate (cas rare 1/120 000) entre un sujet hétérozygote (*1/*3A, donc métaboliseur intermédiaire) et une double hétérozygote (*3C/*3B, métaboliseur lent, cas rare survenant 1/120 000).
Indication du test de génotypage :
 avant la prescription d’azathioprine, 6-mercaptopurine ou thioguanine : dépister les sujets déficients à risque d’hématotoxicité.
Rendu de résultat :

* Chez les métaboliseurs lents (porteurs à l’état homozygote d’un des 3 variants délétères ou chez les doubles hétérozygotes), ne pas prescrire un des 3 cytotoxiques et préférer un autre médicament.
* Chez les sujets hétérozygotes le risque d’hématotoxicité est intermédiaire entre les métaboliseurs lents et rapides ; la conduite à tenir dépend de l’indication :
- en cas de consolidation de LAL de l’enfant, garder la dose normale mais surveiller plus fréquemment le NFS, ces sujets font davantage de neutropénie mais ont également une meilleure réponse clinique il ne faut donc pas leur baisser à priori la posologie +++.
- En transplantation rénale, préférer l’acide mycophénolique à la place de l’azathioprine.
- En cas de maladie de Crohn, diminuer la posologie d’azathioprine de moitié et suivre phénotypiquement l’activité TMPT  ainsi que les concentration de 6-thioguanine nucleosides (6-TGN, métabolites actifs) afin d’ajuster la posologie.



UGT1A1
Rationnel : L'UGT1A1 est un enzyme hépatique de phase II (enzyme de conjuguaison) qui conjugue de nombreux médicaments à l'acide glucuronique. La bilirubine est son substrat endogène le plus connu.  Les gènes spécifiques des 9 isoformes de la famille UGT1A sont formés par épissage alternatif de leur premier exon, les exons 2 à 4 étant communs aux UGT de la famille UGT1. Chez isoforme possède son propre promoteur.
De nombreux médicaments sont éliminés par  l'UGT1A1, l'exemple le plus classique est celui du métabolite actif de l'irinotecan (SN-38), utilisé dans la chimiothérapie du cancer du colorectal métastasique.  Il existe des polymorphismes génétiques à l’origine d’un déficit partiel de l’activité UGT1A1 associé à une hyperbilirubinémie (maladie de Gilbert). Des mutations rares donnent lieu à la maladie de Crigler-Najar. Des études cliniques ont montré le rôle d’un déficit en UGT1A1 dans la survenue de toxicité sévère (neutropénie, diarrhée) de l’irinotécan. 

Identification des SNPs : insertion de 2 pb entre –23 et –38 2-bp INS, TA,
Fréquence du polymorphisme :
Il s’agit de la variation du nombre de doublets TA. Dans l’allèle sauvage, il y a 6 répétitions TA. L’allèle variant le plus fréquemment rencontré correspond à la présence d’un doublet TA supplémentaire.
Les allèles rencontrés sont :.
    UGT1A1*1            A(TA)6TAA    allèle sauvage
    UGT1A1*28            A(TA)7TAA    allèle le plus fréquent
Ce polymorphisme est en déséquilibre de liaison avec le SNP T-3279G.
Les sujets homozygotes pour l’allèle UGT1A1*28 représentent environ 15 % de la population caucasienne, les sujets hétérozygotes UGT1A1*1 / UGT1A1*28 environ 40 %.
Il existe également des polymorphismes de la partie codante : ces mutations sont surtout retrouvées dans les populations asiatiques. Leur corrélation avec les effets indésirables de l’irinotécan  est moins bien établie.
UGT1A1*6        G211A
UGT1A1*7        T1456G
UGT1A1*27        C686A
UGT1A1*29        C1099G
Fonctionalité du polymorphisme : 
Fonctionalité du polymorphisme chez l’homme: La présence de l’allèle UGT 1A1*28 permet d’identifier les différents phénotypes correspondant à une activité de glucuronidation de la bilirubine (activité UGT1A1) diminuée. Les porteurs du variant UFT1A1*28 ont des concentrations circulantes supérieures du métabolite actif SN38. Des études de pharmacocinétique de l’irinotécan ont montré des profils variables en fonction du génotype UGT1A1. Les patients homozygotes UGT1A1*28/*28 sont plus à risques d’effets indésirables graves mais semblent également présenter de meilleurs résultats en terme de survie.


Indication du test de génotypage :
 Dépistage avant mise en route d’un traitement par irinotécan ou explication d’une toxicité sévère


Rendu de résultat :
 La présence de l’allèle UGT 1A1*28 à l’état homozygote  expose à un risque accru d’effets indésirables grâves de l’irinotécan. Cependant si les patients tolèrent la dose normale d’irinotécan, ils semblent avoir de meilleures réponses cliniques. Il faut donc se montrer prudent avant de proposer une adaptation posologique. En tout cas il ne faut pas augmenter les posologies d’irinotécan chez les patients de génotype UGT1A1*28/*28. Dans la crainte d’effet indésirable, reconsidérer le choix de l’irinotécan versus l’oxaliplatine (cancer du colon métastasé).

UGT1A9
Rationnel 
 L'UGT1A9 est un enzyme hépatique de phase II (enzyme de conjuguaison) qui conjugue de nombreux médicaments à l'acide glucuronique. Les gènes spécifiques des 9 isoformes de la famille UGT1A sont formés par épissage alternatif de leur premier exon, les exons 2 à 4 étant communs aux UGT de la famille UGT1. Chez isoforme possède son propre promoteur.

L’UGT1A9 est impliquée dans le métabolisme mycophénolate mofétil. Elle produit un métabolite glucuroconjugué phénolique inactif. Ce métabolite participe au cycle entéro-hépatique du médicament. L’intensité du cycle entéro-hépatique est très variable d’un individu à l’autre et est à l’origine d’une grande variabilité inter-individuelle d’exposition (et donc de réponse) au médicament.
Identification des SNPs :
Variants alléliques:  de nombreux SNPs sont localisés dans le promoteur. Les principaux SNPs de l’exon 1 sont les variants alléliques *2 (G8A, Cys3Tyr) et *3 (T98C, Met33Thr).

Fréquence du polymorphisme : le SNP le plus étudié concernant le métabolisme de l’acide mycophénolique est l’UGT1A9*3 dont la fréquence est de l’ordre de 2-3% dans la population Occidentale.

Fonctionalité du polymorphisme chez l’homme: Quelques études in vitro laissent à penser que l’activité ou l’expression de l’UGT1A9 sont associées à certains polymorphismes. En 2008, c’est l’allèle l’UGT1A9*3 qui semble le plus associé à une activité enzymatique plus basse et des concentrations plasmatiques d’acide mycophénolique plus hautes. Cependant les différences de concentrations entre les génotypes sont généralement minimes de l’ordre de 15 à 20% pour les AUC .

Indication du test de génotypage :
pas d’indication dans le cadre de la routine, réservé actuellement dans le cadre de projets de recherche clinique.
Rendu de résultat :
 aucun dans le cadre des soins de routine.




UDP-glucuronosyltransférase 2B7 UGT 2B7

Rationnel : Les UDP-glucuronosyltransferases (UGT) sont des enzymes catalysant l’addition d’un acide glucuronique sous forme activée, à de petites molécules (aglycones), endogènes ou xénobiotiques. Les réactions de glucuroconjugaison sont le plus souvent associées à une diminution de l’activité pharmacologique ou biologique des aglycones. Mais il existe plusieurs exceptions, et en particulier deux classes de glucuronides à forte réactivité électrophile : les N-O-glucuronides des acides hydroxamiques et les acyl-glucuronides des acides carboxyliques.
L’UGT2B7 est impliquée dans la production de l’acyl-glucuronide du mycophénolate mofétil. In vitro, ce métabolite a des propriétés pro-inflammatoires et il est susceptible de former des adduits avec les protéines plasmatiques ou cellulaires par liaison covalente. Ce métabolite semble être responsable de certains effets secondaires du médicament et en particulier d’épisodes de diarrhées sévères aux caractéristiques particulières (atrophies villositaires duodénales, sans étiologie infectieuse). La diarrhée est l’un des principaux effets indésirables du mycophénolate. Sa prise en charge actuelle implique une réduction progressive de la posologie (et éventuellement l’arrêt) du médicament, ce qui est associé à une augmentation importante du risque de rejet aigu.

b.    variant allélique
L’UGT 2B7 est codée par un gène spécifique d’environ 16 kb, localisé sur le chromosome 4 (locus 4q13) et comportant 6 exons de taille comprise entre 88 et 721 pb. La taille des introns du gène (au nombre de 5) varie de 0,7 à 4,2 kb. La région flanquante 5’ comporte une TATA box et plusieurs sites potentiels de liaison de facteur de transcription.
Plusieurs SNPs (Single Nucleotides Polymorphisms) du gène de l’UGT2B7 ont été identifiés, parmi eux :
•    8 ont été identifiés au niveau du promoteur : A-1246G, T-1239C, T-1052C, G-840A, A-268G, C-147T, T-102C et la G-79A.
•    6 au niveau des exons : exon 1 (A372G), exon 2 (A735G, T801A et C802T) et exon 4 (G1059C et C1062T)

c.    fréquence et impact fonctionnel
Il existe un fort déséquilibre de liaison entre plusieurs de ces différents SNPs.
Les SNPs A-1246G, T-1239C, T-1052C, G-840A, A-268G, C-147T et T-102C sont fortement liés. Ils sont retrouvés à une fréquence de 44 % dans la population et sont associés à une augmentation de l’expression du gène.
Les SNPs G-79A, T801A (Pro267Pro), C802T (His268Tyr) et G1059C (Leu343Leu) sont fortement liés. Ils sont retrouvés à une fréquence de 56 % dans la population et seraient associés à une diminution de l’activité enzymatique.
Les SNPs A735G (Thr145Thr) et C1062T (Tyr344Tyr) sont également fortement liés et sont retrouvés à une fréquence de 11% dans la population et leur impact sur l’activité n’est pas encore bien connu.
Le SNP A372G a une faible fréquence dans la population (< 3 %).
Il a été rapporté une association entre l’exposition à l’acyl-glucuronide du mycophénolate et la mutation G-840A chez des patients transplantés rénaux recevant du mycophénolate mofétil en association avec le sirolimus (Djebli N et col. 9th International Congress of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology. Louisville, USA. 23-28 avril 2005 : abstract in : Ther Drug Monit. 2005; 27:246).
 
2-    Indication potentielle

Bilan pré-greffe (mycophénolate mofétil).

3-    Applications cliniques

Le génotypage de l’UGT 2B7 pourrait constituer :
-    Un facteur prédictif du risque de survenue de diarrhée sous mycophénolate et par conséquent un critère de choix ou d’éviction de ce médicament (bilan pré-greffe)
-    Un test diagnostic permettant de confirmer ou d’infirmer l’implication du mycophénolate devant une diarrhée non fébrile persistante et avant de décider de réduire la posologie du mycophénolate.
Ces applications potentielles sont en cours de validation dans le cadre de l’étude MMF-GENTOX (ATC INSERM 2004 ; Coordinateur Pr Pierre Marquet, Limoges).

4-    Méthodes (Préciser technique, coût / échantillons)

-    PCR-RFLP ou séquencage (Lille)
-    Technique PCR en temps réel (technologie Taqman) après extraction d’ADN génomique à partir d’1 ml de sang total prélevé sur tube EDTA (Limoges)

NB : Il n’existe pas de méthode de phénotypage de l’UGT 2B7

5-    Rendus des résultats (délai et commentaire associé

 

NAT2 (merci à Estelle)
Rationnel : NAT2 est une enzyme hépatique cytosolique de phase II qui ajoute un radical acétyl à ses substrats.. Elle est impliquée dans l'élimination de certains médicaments comme l'isoniazide, les sulfamides, la procaïnamide, l'hydralazine, la dapsone, l'acébutolol, la sulfasalazine, la sulfaméthazine. Il existe de nombreux polymorphismes génétiques de NAT2 (plus de 30 SNP formant 60 haplotypes, cf: http://louisville.edu/medschool/pharmacology/consensus-human-arylamine-n-acetyltransferase-gene-nomenclature/nat_pdf_files/Human_NAT2_alleles.pdf).

Identification des SNP : Afin d'identifier plus de 96% des phénotypes lents, 4 SNPs, taguant 4 haplotypes associés au phénotype lent sont à identifier: SNP 341T>C, Ile114Thr, rs1801280 ; SNP 590G>A, Arg197Gln, rs1799930 ;  SNP 857G>A, Gly286Glu, rs1799931 ;  SNP 191G>A, Arg64Gln, rs1801279.

Fréquence des polymorphismes : Par convention l’allèle sauvage est l’allèle NAT2*4. Ceci correspond donc à une fréquence d'acétyleurs lents de plus de 50% dans la population caucasienne, d'environ 10% au Japon avec un prédominance de l'allèle NAT2*6 chez les acétyleurs lents asiatiques et pouvant atteindre 75% dans certaines populations africaines.

L’haplotype NAT2*5 est Tagué par le SNP 341T>C, Ile114Thr, rs1801280 (FA Occidentaux :0,44. Africains : 0,28. Asiatiques : 0,03)

L’haplotype NAT2*6 est Tagué par le SNP 590G>A, Arg197Gln, rs1799930 (FA Occidentaux : 0,30. Africains : 0,17 à 0,30. Asiatiques : 0,20) L’haplotype NAT2*7 est Tagué par le SNP 857G>A, Gly286Glu, rs1799931 (FA Occidentaux : 0,02 . Africains : 0,05. Asiatiques : 0,20)

L’haplotype NAT2*14 est Tagué par le SNP 191G>A, Arg64Gln, rs1801279 (FA Occidentaux : 0,00 . Africains : 0,09. Asiatiques : 0,00)

Fonctionnalité des allèles : Les différents SNPs décrits conduisent soit à une réduction du taux d'ARNm et donc de l'expression de la protéine NAT2 (c'est le cas des allèles NAT2*5B et 5D) ou à une instabilité protéique aboutissant à une dégradation plus rapide de NAT2 (c'est la cas de NAT2*6D et *14G). L'activité de NAT2 dans la population peut donc se répartir en 3 groupes (phénotypes différents) :

 - Les métaboliseurs "acétyleurs" rapides (homozygote pour l'allèle sauvage NAT2*4)

- Les métaboliseurs "acétyleurs" intermédiaires (1 allèle sauvage et 1 allèle muté)

- Les métaboliseurs "acétyleurs" lents (2 allèles mutés).

Ces 3 phénotypes pouvant être détectés par un test utilisant la caféine ou l'isoniazide en recherchant le taux de métabolites après un temps défini dans les urines pour la caféine ou dans le sang, 3 heures après la prise d’isoniazide. Il existe une bonne corrélation entre génotype et phénotype pour NAT2  Kinzing 2005 et Donald 2007.

 Conséquence clinique : L'activité de NAT2, dépendante du nombre d'allèles sauvages NAT2*4 présents chez l'individu, expliquerait 88% de la variabilité de la clairance à l'isoniazide  Kinzing-Schippers 2005. . Huang  2002  ont observé que les acétyleurs lents ont un risque plus important de développer une hépatotoxicité (OR= 7) avec l’isoniazide, d'avoir des taux de transaminases plus élevées et donc une atteinte hépatique plus sévère que les acétyleurs rapides .

 Indication du test de génotypage : Avant la mise en route d'un traitement antituberculeux associant l'isoniazide aux molécules de référence afin d'identifier les métaboliseurs lents et intermédiaires pour surveiller le risque d'hépatotoxicité.

Rendu de résultat : Acétyleurs lent, intermédiaire ou rapide. Avant la mise en route de l'isoniazide, identifier la posologie à utiliser car une relation linéaire entre clairance de l’isoniazide et le nombre d'allèles NAT2*4 présents a été retrouvée par Kinzing-Schippers 2005 et Donald  2007

Si absence d'allèle NAT2*4 --> Posologie de l'INH = 3 mg/kg/j

Si présence d'un seul allèle NAT2*4 --> Poslogie de l'INH = 5 mg/kg/j

Si présence des 2 allèles NAT2*4 --> Posologie de l'INH = 6 mg/kg/j

Si introduction de l'INH déjà réalisée, surveillance accrue de la fonction hépatique chez les acétyleurs lents.